背景﹥﹥

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正常组织来源的细胞在体外培养条件下可分裂生长，但经过有限次数的传代后，就会停止增殖，发生衰老和死亡，这种现象称之为海弗利克极限。细胞经过自发的或受外界因素的影响从增殖衰老危机中逃离, 从而具有无限增殖能力的过程称为细胞永生化(cell immortalization) 。

与正常细胞相比，永生化细胞具有以下优点：

1. 可使传代次数少、增殖慢、易分化衰老的细胞获得永生，且永生化后更易于培养，节省培养成本，在短时间内可大量扩增，为研究提供充足的细胞；

2. 永生化细胞可建立稳定细胞库，基因表型稳定均一，有助于得到一致且可重复的实验结果，是体外研究细胞增殖、分化、凋亡、衰老等的理想模型；

3. 永生化细胞和肿瘤细胞关系密切，可以为肿瘤发生机制的研究提供重要参考。 

使细胞获得永生化的方法主要是从基因组层面对细胞进行一定改造。主要途径有：

1）放射性或药物诱导；2）激活原癌基因；3）使抑癌基因失活；4）慢病毒、EB病毒等；5）整合端粒酶催化亚基。

本公司可以为客户提供永生化慢病毒包装，细胞感染，单克隆挑选以及表型鉴定等多项相关服务

注意: 本服务仅用于进一步科研使用，不可用于临床治疗等其他用途。

原理﹥﹥

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慢病毒（Lentivirus）载体是常用的基因整合工具，属于假性病毒，免疫源性低，可有效感染分裂和非分裂细胞，感染宿主细胞后，慢病毒基因可反转录整合到宿主细胞染色体中，实现长时间稳定表达，目前广泛应用于基因敲除、敲入、基因过表达、RNA干扰等研究。

通过在慢病毒载体上插入永生化基因及抗性筛选基因，可获得永生化慢病毒载体。感染后，在培养基中加入对应的抗生素，未完成感染的细胞由于缺乏抗性被清除，感染成功的细胞获得抗性，继续存活。经过一段时间的筛选后，可获得带有抗性及永生化基因的细胞。

单克隆筛选是将单个细胞从混合的细胞样品中分离出来的一种技术，从单个细胞扩增出来的细胞株具有基因表型稳定、性状统一等优点，广泛应用于是抗体制备细胞株优化、稳转细胞株构建、药物靶点筛选等。具体方法有流式细胞术挑选、有限稀释法、半固体培养基挑选法，主要难点在于将细胞分离出来并持续扩增。

永生化成功的标志：细胞表型未发生转化（形态观察以及标志物检测）；细胞可以持续稳定地分裂（与原代细胞同步传代验证）。

服务概述﹥﹥

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客户提供原代细胞，告知所用培养基及培养方法，沟通确定所用病毒载体后，本公司可按下列步骤完成细胞永生化服务。

参考文献﹥﹥

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1. Salmon, P., Oberholzer, J., Occhiodoro, T., Morel, P., Lou, J., & Trono, D. (2000). Reversible Immortalization of Human Primary Cells by Lentivector-Mediated Transfer of Specific Genes. Molecular Therapy, 2(4), 404–414.

2. Lehman, T. A., Modali, R., Boukamp, P., Stanek, J., Bennett, W. P., Welsh, J. A., … Harris, C. C. (1993). p53 Mutations in human immortalized epithelial cell lines. Carcinogenesis, 14(5), 833–839.

3. Bodnar, A. G. (1998). Extension of Life-Span by Introduction of Telomerase into Normal Human Cells. Science, 279(5349), 349–352.

4. Wang, D., Liebowitz, D., & Kieff, E. (1985). An EBV membrane protein expressed in immortalized lymphocytes transforms established rodent cells. Cell, 43(3), 831–840.

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